RNA是存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體，不同類型RNA具有不同的作用。轉移RNA（tRNA）在蛋白質翻譯中起著重要作用。如果tRNA中發生錯誤修飾或修飾缺失，會產生錯誤或不完整的蛋白質。

已有研究發現，多種tRNA修飾酶的突變與各種人類疾病有關，包括神經退行性疾病、代謝疾病和癌癥。但是，研究tRNA一直面臨著諸多挑戰，部分原因是缺乏一種同時量化其豐度和化學修飾的簡單方法。因為目前的納米孔測序設置會丟棄絕大多數tRNA reads，測序產量低，并且基于轉錄物長度對tRNA豐度的表示有偏差。 

 近日，來自西班牙巴塞羅那科學技術研究所的研究團隊及合作者在Nature Biotechnology發表了題為“Quantitative analysis of tRNA abundance and modifications by nanopore RNA sequencing”的研究論文。研究團隊開發了一種名為Nano-tRNAseq的tRNA納米孔測序新方法，可直接對天然tRNA進行精確測序，準確定量tRNA豐度并同時捕獲tRNA修飾變化。研究團隊利用Nano-tRNAseq成功檢測了釀酒酵母tRNA群同一分子內不同tRNA修飾類型之間的串擾和相互依賴性，以及tRNA群體對氧化應激的反應變化。

圖1.文章發表在Nature Biotechnology

牛津納米孔技術公司（ONT）開發的直接RNA測序（DRS）平臺是基于NGS技術來描述tRNA組的一個很有潛力的替代方案。該技術允許對天然RNA分子進行直接測序，因此，原則上可以檢測和定量tRNA修飾和tRNA豐度，不需要逆轉錄或PCR。先前的研究已經證明，納米孔可以使用固態或生物（ONT）納米孔捕獲tRNA。通過連接接頭來延長tRNA分子，tRNA可以通過生物納米孔進行測序、基礎標記和定位。但上述方法tRNA分子的測序產量較低，并且沒有報告是否使用該方法再現了現存的體內tRNA豐度和/或tRNA修飾。

研究團隊發現，對原始納米孔信號強度再處理，用RNA接頭填充5′和3′tRNA末端，可以準確地進行堿基判定和映射，并捕獲整個tRNA序列，使tRNA reads的數量增加12倍，并獲得準確的tRNA豐度。這種基于納米孔的方法被命名為Nano-tRNAseq（圖1），可用于對天然tRNA進行測序，并在單個實驗中獲取到tRNA豐度和修飾動力學的定量估計。研究團隊表示，在體外和天然tRNA分子測序、堿基判定和映射方面，Nano-tRNAseq方法是使用納米孔進行DRS最成功的方法。

圖2.Nano-tRNAseq可以有效地對天然tRNA進行測序

天然tRNA具有短而高度修飾的特性，這使它們的比對具有挑戰性。對DRS數據集中修改堿基的不準確判定也使原tRNA檢測含有很大比例的不匹配堿基。由于這些錯誤的堿基，使用推薦設置的常用長讀長映射工具minimup2（-ax-map ont-k15）僅可以比對一小部分reads（2.56%）。為了提高Nano-tRNAseq reads可映射性，研究團隊測試了短reads映射算法BWA，發現使用推薦參數的BWA-MEM比對在映射readas的比例方面優于minimup2。

當使用參數為-W13 -k6 -xont2d -T20的BWA-MEM時，發現增加的映射reads和錯誤比對之間存在最佳平衡，映射了54.63%的reads，錯誤比對很少（0.19%）。當在天然tRNA分子中比較兩個映射算法的性能時，對比更加明顯。隨后，研究人員評估了Nano-tRNAseq reads的可映射性是否受5'和3' RNA接頭長度的影響。研究發現，即使參考序列中沒有RNA接頭，短的和未修飾的序列也可以有效地比對，而短的和修飾的reads則從帶有接頭的延伸序列中受益匪淺，表明帶有RNA接頭的延伸序列分子對于指導富含“錯配”短reads的正確比對至關重要，例如來自天然tRNA的短reads。