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small RNA提取
1.核酸提取
1.1什么是核酸
核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據功能的不同分為核糖體RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和轉移RNA（tRNA）。
1.2核酸提取純化原則和要求
保證核酸一級結構完整型； 排除其他分子的污染；
1.3.常見的核酸提取方法
a、溶液型抽提溶液型抽提是比較經典的提取方法，幾乎都含有去污劑（如 SDS ）和鹽(如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環境，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞（如 EDTA ）、維持核酸結構的穩定（如 NaCl ）等。去污劑則是通過使蛋白質變性，破壞膜結構及解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸游離在裂解體系中。這種方法雖然成本較低，但較為繁瑣，提取的核酸質量也較為一般。
b、柱式抽提
柱式抽提是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法，其基本原理是利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來。 把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。再把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。
其成本較低，但提取質量較好，是目前市場的主流提取方法。
c、磁珠法提取
磁珠純化法與硅膠膜離心柱的原理基本相同，運用納米技術對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在 Chaotropic 鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和外加磁場的作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的 DNA 和 RNA 分離出來。
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small RNA文庫構建
文庫構建
1.1DNA文庫構建
DNA文庫構件上構建是二代測序技術的基礎，DNA文庫構建的本質就是將待測定樣本的大片段基因組DNA片段化為小片段的DNA，之后在小片段的DNA分子兩端添加測序接頭，形成能上機測序的有效地文庫分子的過程。DNA文庫構建流程主要包括：DNA片段化、末端修復、A尾添加、接頭連接、PCR富集五個步驟。
1.2RNA文庫構建 二代測序RNA文庫的構建，根據RNA的種類主要分為mRNA文庫、lncRNA文庫、small RNA文庫等。mRNA和lncRNA文庫構建流程包括：RNA富集、RNA片段化、cDNA第一鏈合成、二鏈合成、PCR富集。RNA富集是mRNA及lncRNA文庫構建的必要步驟，這是因為rRNA在總RNA中的占比超過80%，如不進行rRNA取出操作，mRNA及lncRNA文庫的測序數據中絕大部分為rRNA的相關數據，不利于全面深入分析mRNA及lncRNA的表達差異及序列變化。Small RNA文庫構建與mRNA和lncRNA文庫的構建流程略有差異，主要包括：3’接頭連接及封閉、5’接頭連接、cDNA合成、PCR富集。
2.cfRNA
面對癌癥，“上工治未病”顯得尤其重要，有效的早期診斷對癌癥治療有極大幫助：經由早期診斷的患者，五年生存率要比晚期患者高 5-10倍。因此盡早發現癌癥可以給患者提供最好的治愈機會。目前，即使全世界范圍內，早期診斷技術還沒有成熟，一個易于普及、 高特異高敏感的檢測方法是癌癥早期診斷和篩查的瓶頸所在。 液體活檢技術是人們期望很大的一類癌癥早期檢測技術，其標志物包括了循環腫瘤細胞（CTC）、細胞外DNA（cfDNA）及其甲基化、細胞外 RNA(cfRNA)、外泌體蛋白等。與CTC/cfDNA相比，cfRNA作為癌癥標志物至少有以下3個優勢： 1.敏感性和功能性： RNA可以通過細胞外排機制，如外泌體，更主動地進入細胞之外的環境中, 因此，基于cfRNA的生物標志物不僅在癌癥早期就有很多信號出現在病人血漿中，而且可以提供更多的功能學信息。 2.組織特異性： 很多RNA（包括人源和微生物源）的表達是有組織特異性的，因此，不同腫瘤中特異RNA表達譜的改變可以反映在血漿中。 3.低成本： 針對癌癥信號的有效的cfRNA 測序相對于cfDNA及其甲基化測序成本更低，對早篩早診的普及更有利。 2022年7月11日，生命學院魯志團隊與北京大學第一醫院王鵬遠團隊、南昌大學徐振江團隊等多家單位的醫療和科研人員合作，在生物醫學權威期刊eLife上發表題為“利用血漿中人和微生物來源的無細胞RNA進行癌癥類型分類”（Cancer type classification using plasma cell-free RNAs derived from human and microbes）的研究論文，報導了細胞外RNA（cfRNA）在泛癌早期診斷中的應用和前景。
Fig.1 研究方法和路線
研究發現：利用人類血漿中小 RNA（small RNA）之外的更長更微量的cfRNA（包括了mRNA, lncRNA, circRNA 等），通過生物信息學分析和機器學習模型的整合，可以很好地診斷常見五大癌癥（結腸癌、胃癌、肝癌、食道癌、肺癌），AUC（曲線下面積）達到0.91（尤其是肝癌可以達到0.95以上）。值得一提的是，本研究特別強調針對早期癌癥的研究（65%以上的病例屬于早期腫瘤），即使在所有早期病例隊列里，診斷AUC仍可以達到0.9，揭示了cfRNA 在癌癥早期診斷中的價值。另外，在人源cfRNA基礎上，如果結合微生物來源的cfRNA，還可以更加準確地區分癌癥組織類型。
Fig.2 cfRNA可以用于癌癥診斷
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